Il giovane studente Peter Parker (Tobey Maguire) vive con gli anziani zii, studia al college, è innamorato della bella Mary Jane (Kirsten Dunst), ha l'hobby della fotografia ed è molto timido con le ragazze. Peter Parker, in pratica, è un comunissimo adolescente americano.
Non per molto però. Un incidente cambia radicalmente la sua vita. Durante una gita con la sua classe in un laboratorio che compie ricerche biologiche, viene morso da un ragno geneticamente modificato che gli procura dei poteri eccezionali. Peter diventa fortissimo, gli scompare la miopia, riesce a 'sentire' il pericolo, ha un'agilità da ragno e come un ragno produce una ragnatela molto resistente e può arrampicarsi sulle pareti a mani nude.
Peter cerca da subito di sfruttare il suo nuovo stato, ma ben presto, a causa della tragica morte dello zio e delle continue minacce alla sua vita privata, il timido studente assume l'identità segreta di Spider-Man, un supereroe che si ritrova a combattere il crimine vendicandosi dell'assassino di suo zio e soprattutto per scaricare la sua coscienza. La sua nemesi è rappresentata da Goblin, ossia il magnate degli armamenti Norman Osborn (Willem Dafoe), scienziato e fondatore della Oscorp, che esegue su se stesso un esperimento su un gas per la superforza ancora in fase sperimentale pur di riuscire a rispettare i termini stabiliti con l'esercito e non perdere il contratto a favore di una compagnia rivale. L'esito del test è drammatico: Osborn quasi muore e deve esser rianimato dal suo collega Mendel Stromm. Appena ripresa conoscenza in un impeto di follia lo uccide.
Degli avvenimenti non ricorda nulla: in lui iniziano a coesistere due personalità distinte. Il suo lato più oscuro e malvagio prende spesso il sopravvento e, sfruttando la tecnologia della supertuta verde e dell'aliante Oscorp, unita alla sua superforza e resistenza, con il viso coperto da un casco dai lineamenti simili a quelli di un Goblin, distrugge la base della compagnia avversaria uccidendone i dirigenti nonché il generale dell'esercito che non aveva fiducia in lui. Le azioni della compagnia vanno alle stelle e Osborn, che non ricorda i suoi misfatti, è molto soddisfatto. Quando però i suoi soci del consiglio di amministrazione decidono di vendere la Oscorp contro il suo volere, Osborn si abbandona di nuovo al suo lato malvagio e, durante una manifestazione della Festa del Ringraziamento, li uccide tutti lanciando una bomba sulla balconata dove erano riuniti. In questa occasione si scontra per la prima volta con Spider Man, ossia Peter Parker, migliore amico di suo figlio Harry (James Franco). A quest'ultimo non ha mai dato molta considerazione, preferendogli effettivamente Peter, più intelligente e capace. I giornali etichettano l'identità criminale di Osborn col nome Green Goblin (in italiano "folletto verde").
Finalmente Norman si rende conto che lui e il Goblin sono la stessa persona ed elabora un piano per formare un'alleanza con Spider-Man e poi controllare New York. Ovviamente il supereroe rifiuta in ben due occasioni ma nell'ultimo scontro resta ferito ad un braccio. Norman riscontra poi la stessa ferita sul braccio di Peter Parker, mentre stanno pranzando insieme. Sconvolto se ne va e, venuto meno l'affetto che provava nei suoi confronti, decide di attaccare Parker colpendo i suoi cari per fargliela pagare. Prima manda in stato di shock la vecchia zia di Peter, May, sfondando una parete della sua casa e minacciandola, e poi rapisce Mary Jane Watson, la ragazza di cui Peter è innamorato. Intanto riallaccia anche i rapporti con suo figlio Harry, che dopo tanto tempo sente di aver davvero un padre. Dopo aver portato Mary Jane sul ponte di Brooklyn ingaggia con Spider-Man una battaglia mortale (dove il nostro eroe con uno sforzo sovrumano salva Mary Jane e una funivia piena di bambini), che si conclude in una casa abbandonata. Peter sta per sconfiggere Goblin quando questi gli svela di esser Norman Osborn, una figura cui comunque il ragazzo è molto legato. Osborn chiede pietà e giustifica i suoi crimini dando la colpa all'influenza di Goblin, intanto però richiama il suo aliante con l'intenzione di trafiggere Peter alle spalle. Questi però si scansa appena in tempo ed è lo stesso Osborn a restare ucciso. Spider-Man riporta il corpo di Osborn nella sua casa ma è sorpreso da Harry, che si convince che lui lo abbia ucciso e giura vendetta.
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